經(jīng)真空冷凍干燥得到的乳酸菌發(fā)酵劑存活率和后期的低溫貯藏穩(wěn)定性與諸多因素相關。本文綜述了制備乳酸菌發(fā)酵劑過程中高密度發(fā)酵和真空冷凍干燥工藝的不同對乳酸菌抗冷凍性的影響，其中高密度發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵恒定pH、中和劑的選擇、菌體收獲時期和發(fā)酵結束后處理以及真空冷凍干燥過程中保護劑的添加、預冷凍處理等是影響乳酸菌抗冷凍性的重要因素。通過對這些相關因素的綜述分析，為提高乳酸菌發(fā)酵劑的凍干存活率和后期的低溫貯藏穩(wěn)定性提供新的思路，且應用抗冷凍性強、活力高的乳酸菌發(fā)酵劑對有效提高乳制品的質(zhì)量和企業(yè)的經(jīng)濟效益意義重大。

近年來，乳酸菌的研究與相關產(chǎn)品的開發(fā)得到迅猛發(fā)展，但仍有許多問題需要解決，其中乳酸菌發(fā)酵劑在真空冷凍干燥過程中的存活率和低溫貯藏穩(wěn)定性極其重要，直接影響著企業(yè)的經(jīng)濟效益，而影響乳酸菌抗冷凍性的不僅僅是真空冷凍干燥工藝，更重要的還有前期的高密度發(fā)酵工藝，且后者往往被乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)者所忽視。高密度發(fā)酵是近年來發(fā)展起來的發(fā)酵技術，它不僅是生產(chǎn)高質(zhì)量的濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié)，也是工程菌和非工程菌能否實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關鍵性因素。高密度發(fā)酵得到的菌體需要通過一些手段去除其中的水分，以使得乳酸菌能夠長期貯藏并保持較高的活力，并能夠方便地應用于乳制品的生產(chǎn)中，而真空冷凍干燥可以滿足上述要求，可在真空條件下將預凍樣品中的冰直接升華，實現(xiàn)低溫條件下去除水分的目的。

目前，z*大限度地提高乳酸菌存活率及后期的低溫貯藏穩(wěn)定性至關重要，因此優(yōu)化乳酸菌的高密度發(fā)酵工藝及真空冷凍干燥工藝以提高乳酸菌發(fā)酵劑的凍干存活率和貯藏穩(wěn)定性具有重大意義。

1、乳酸菌高密度發(fā)酵工藝對其抗冷凍性的影響
1.1、培養(yǎng)基的組分及含量對其抗冷凍性的影響

培養(yǎng)基的組分對乳酸菌的抗冷凍性影響較大，因此在乳酸菌的培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，不僅要以發(fā)酵液活菌數(shù)作為參考指標，更重要的是要參考在該種培養(yǎng)基下培養(yǎng)得到的乳酸菌在后期的真空冷凍干燥過程中的存活率，以得到一個具有實際經(jīng)濟效益的培養(yǎng)基。

1.1.1、培養(yǎng)基中的碳源、氮源對其抗冷凍性的影響: 培養(yǎng)基的組分對乳酸菌抗冷凍性影響較大，其中碳氮源是主要的影響因素，培養(yǎng)基中的糖類一方面可作為細胞生長的碳源，另一方面也可作為生長培養(yǎng)基中滲透性應激誘導物。Wang 等對嗜酸乳桿菌RD758 在乳糖缺少的情況下培養(yǎng)并研究其抗冷凍性的變化。在乳糖缺少的情況下嗜酸乳桿菌RD758 表現(xiàn)出較高的抗冷凍性和活力，通過氣相色譜對乳糖缺少的培養(yǎng)條件下嗜酸乳桿菌RD758 細胞膜脂肪酸的種類及含量的測定發(fā)現(xiàn)，其細胞膜不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量減少即細胞膜的流動性增強; 通過雙向電泳研究發(fā)現(xiàn)乳糖缺少的情況下，有11 種與代謝有關的新蛋白質(zhì)合成，且另有一種應激蛋白質(zhì)的合成量是乳糖充足時合成量的3 倍。包維臣等研究表明保加利亞乳桿菌ND02 在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵時其存活率不同，當培養(yǎng)基的氮源由酵母浸粉變?yōu)閯游锏鞍纂藭r，其凍干菌粉活菌數(shù)由1×109 CFU/mL 變?yōu)?×109 CFU/mL，且真空冷凍干燥過程的存活率明顯升高。

1.1.2、培養(yǎng)基中的金屬離子對其抗冷凍性的影響: 培養(yǎng)基中的金屬離子對乳酸菌的抗冷凍性影響較大。嗜酸乳桿菌NCFM 和RL8Kr、RL8Ks在培養(yǎng)基中添加鈣離子時，其存活率可提高到80%和89%，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)添加鈣離子后其細胞形態(tài)由長細絲狀變?yōu)槎虠U狀，而相關研究表明細胞為短桿狀時抗冷凍性較強。

Wright、Bèal 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)保加利亞乳桿菌1243-F 和嗜熱鏈球菌CFS2 時，鈣離子添加量z*適濃度范圍是3.4×10?3?6.7×10?3 mol/L，且其抗冷凍能力并不隨培養(yǎng)基中鈣離子的濃度增高而增強。鈣離子所帶有的陰離子不僅可有效中和其在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的乳酸，防止其對收獲和濃縮前的菌體細胞造成過酸損傷，同時鈣離子的添加還可以提高促進因子如油酸和吐溫-80 的效力，這是由于冷凍期間細胞內(nèi)液體狀態(tài)變?yōu)橐后w冰晶狀態(tài)降低細胞膜的流動性，改變飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸之間的比例，而不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例越高其抗冷凍能力越強。相關研究表明，當鎂離子與鈣離子復合使用時，其抗冷凍能力相對減弱; 而與鈣離子相反，若在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽，雖可起緩沖和抗噬菌體作用，

但它可使球菌和桿菌的形態(tài)發(fā)生改變，從而降低了乳酸菌冷凍干燥中的存活率。Carvalho 等研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌EF1 和耐久腸球菌ED1 在錳離子缺失的情況下，大部分乳酸菌對氧自由基的敏感度增加，因為錳離子對存在于細胞內(nèi)的含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的結構至關重要，可以保障含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶發(fā)揮其作用。這類含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶在乳酸菌不同的種屬中均有發(fā)現(xiàn)，對保護乳酸菌抵抗氧自由基有著重要作用，從而對低溫條件下乳酸菌穩(wěn)定性的提高起著積極作用。

1.1.3、培養(yǎng)基中的其它成分對其抗冷凍性的影響: 一些培養(yǎng)基的組分直接影響著乳酸菌細胞膜結構的變化，可以使不飽和脂肪酸含量相對增加。吐溫-80 的添加可提高乳酸菌的抗冷凍性，F(xiàn)onanda 等[7]研究表明，在培養(yǎng)基中添加吐溫-80可以改善乳球菌和乳桿菌的活性，增加細胞膜中不飽和脂肪酸的組成，從而改變細胞膜的流動性，進而影響其存活率。鈣離子與吐溫-80 復合使用對其存活率的提高更有效。

1.2、乳酸菌的生長溫度對其抗冷凍性的影響

乳酸菌適宜的生長溫度對其抗冷凍性具有重要的影響，很多研究發(fā)現(xiàn)細胞的生長溫度通過改變其細胞膜內(nèi)脂肪酸的組成而影響其存活率。嗜酸乳桿菌RD758、嗜酸乳桿菌CRL640、棒狀乳桿菌Si3 及保加利亞乳桿菌L2 在30 °C、35 °C、37 °C 分別發(fā)酵培養(yǎng)時，通過比較冷凍前后酸化活力的差值可知，在30 °C 培養(yǎng)時其抗冷凍能力z*強，凍干存活率高達67%，此時細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸C18:2 組成明顯增加; 此外低溫培養(yǎng)還會影響菌體多糖合成，乳酸菌在27 °C 培養(yǎng)比在37 °C 產(chǎn)生的不溶性多糖高3?5 倍，而這種多糖物質(zhì)可以提高冷凍干燥存活率[8?11]。通過以上綜述得知，當乳酸菌在其z*適生長溫度低2 °C 下培養(yǎng)生長時，能達到較高的抗冷凍性，當生長溫度高于或低于z*適生長溫度10 °C 時，其抗冷凍性會有所下降。

1.3、高密度發(fā)酵過程中恒定pH 對乳酸菌抗冷凍性的影響

乳酸菌生長的pH 對其抗冷凍能力具有重要的影響。在優(yōu)化高密度發(fā)酵過程中的恒定pH 時，選擇較低的酸性環(huán)境更有利于提高乳酸菌的抗冷凍性，但這個過程可能會影響到乳酸菌發(fā)酵液的活菌數(shù)進而影響到z*終的產(chǎn)量，因此在綜合諸多因素的情況下，選擇較合適的恒定pH 十分重要。

球菌更適合在pH值較高(6.0)的41 °C 條件下生長; 桿菌更適合在pH 值較低(5.0)的41 °C 條件下生長。羅伊氏乳桿菌ATCC55730、嗜酸乳桿菌RD758 和酒酒球菌SD-2a 在恒定pH 為5.0 的培養(yǎng)基中生長時其抗冷凍能力強，而在pH 為6.0?6.8 時抗冷凍能力較差; 當pH 為5.0 條件下培養(yǎng)時細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸C19:0 比例較高，其抗冷凍性增強。Zavaglia 等研究表明不飽和脂肪酸含量的增加有助于嗜酸乳桿菌抗冷凍特性的提高，而細胞膜內(nèi)C19:0 脂肪酸含量的增加有助于保加利亞乳桿菌抗冷凍特性的提高。干酪乳桿菌Zhang 和嗜酸乳桿菌CFS2 在pH 為5.8 發(fā)酵時，其抗冷凍性較好，通過不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例分析發(fā)現(xiàn)，此pH 可以引起細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的積累，過酸和過堿都對其生長速率和存活產(chǎn)生一定抑制。但在添加油酸之后，pH 的影響將會失去，因為油酸可使細胞膜流動性增強，有利于細胞的跨膜轉運。包維臣研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌ND02 在普通MRS 培養(yǎng)基中生長12 h 后，不同恒定pH 對其細胞形態(tài)學影響很大，當pH 為5.7 時細胞形態(tài)為細長形，而當pH 為5.0 時細胞呈現(xiàn)短粗狀。

1.4、高密度發(fā)酵過程中中和劑對乳酸菌抗冷凍性的影響

乳酸菌在生長的過程中會產(chǎn)生大量酸，這些酸會抑制其生長，因此必須選擇適當?shù)闹泻蛣┦蛊渚S持恒定的pH，利于乳酸菌的生長，進而提高其抗冷凍能力。Fonseca 等研究表明，嗜熱鏈球菌CFS2、保加利亞乳桿菌CFL1 及乳脂鏈球菌ML1 培養(yǎng)時調(diào)整pH 所用的中和劑由20%氨水變?yōu)?0% NaOH 時，其發(fā)酵液活菌數(shù)由1.1×1010 CFU/mL 變?yōu)?.7×109 CFU/mL，其真空冷凍干燥存活率明顯降低; 李妍等也研究表明不同的中和劑對干酪乳桿菌Zhang 的生長影響不一，其中25%的氨水效果z*好。弱堿氨水更適合作為中和劑是由于氨水中游離的NH4+更容易透過細胞壁刺激其生長，且可以通過降低蛋白水解酶活性而限制糖酵解的速度。張興昌[17]研究表明不同的中和劑對嗜熱鏈球菌ND03 高密度發(fā)酵中耗堿量和存活率的影響差異顯著，當中和劑為30% Na2CO3 溶液時，比氨水少消耗約20 mL，但用25%氨水作中和劑時存活率較30% Na2CO3 作中和劑存活率高，因此選擇合適的中和劑對乳酸菌的存活率有重要影響。

1.5、菌體細胞的收獲時期對其抗冷凍性的影響

乳酸菌在生產(chǎn)的過程中為了得到更高的活菌數(shù)，必須把菌體從培養(yǎng)基中離心收集從而使菌體與代謝中產(chǎn)生的毒物(如乳酸鹽等)分開，從生理狀態(tài)上講對提高冷凍干燥后存活率有益，而收獲過程中直接影響生存能力的則是菌體的菌齡。酒酒球菌SD-2a 在生長的過程中隨著葡萄糖代謝產(chǎn)物等一系列有機酸的產(chǎn)生，其生長pH 從對數(shù)期中期的4.8 下降到穩(wěn)定期初期的3.6，細胞在此生長過程中細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率由30.5%降低到26.6%。研究發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期中期收獲的菌體較穩(wěn)定期初期收獲的菌體經(jīng)凍干后的存活率高8 倍，存活率高達85%。Lee 等研究表明，乳乳球菌DRC-2 和DRC-2C在10 °C 預冷處理4 h 后，對數(shù)期存活率較低，分別為28.5%和34.7%，而穩(wěn)定期存活率為60%和61.2%。

1.6、高密度發(fā)酵結束后處理對其抗冷凍性的影響

細胞培養(yǎng)結束后的后處理對其抗冷凍性有極其重要的影響，研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌ND02和嗜熱鏈球菌ND03 在培養(yǎng)結束后，將發(fā)酵終點的發(fā)酵液pH 分別調(diào)至6.5 和6.6，溫度降低到30 °C 以下離心時，離心后兩個菌的產(chǎn)酸活力均高于未調(diào)pH 所得菌體，且其凍干后存活率大大提升。張中青等[26]研究發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期末期保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌液中添加2% (W/V)NaCl 短暫刺激2 h 后，收集菌體其凍干存活率達

到65%，且存活率是對照組即直接預凍并進行真空冷凍干燥細胞的1.43 倍，因而選擇合適的刺激持續(xù)時間才能達到良好的效果。同時通過反相

高效液相色譜法測得，菌體胞內(nèi)磷酸果糖激酶(PFK)在凍干前活性為1.409 5 U/mg，NaCl 刺激后活性提高37.4%; 凍干后活性降低為0.968 5 U/mg，NaCl 刺激使PFK 活性增加31.4%。冷凍干燥過程影響了保加利亞乳桿菌正常生理代謝所需關鍵酶PKF 的活性，NaCl 刺激能有效地減少冷凍干燥過程對PKF 酶活的影響是由于NaCl 改變了細胞內(nèi)輔因子水平，進而起到保護細胞的作用。因此高密度發(fā)酵結束后處理對乳酸菌存活率有很大的影響。張興昌[17]研究發(fā)現(xiàn)離心前將嗜熱鏈球菌ND03 的發(fā)酵液pH 調(diào)到6.6，離心后菌種產(chǎn)酸活力高于沒調(diào)pH，其凍干存活率明顯升高。

2、乳酸菌的凍干工藝對其抗冷凍性的影響
2.1、保護劑的添加對乳酸菌抗冷凍性的影響

凍干保護劑是影響凍干發(fā)酵劑活力z*重要的外部因素，因此乳酸菌在凍干前加入適當?shù)谋Ｗo劑，可以提高細胞的存活率，并且可以改善保藏期間乳酸菌的穩(wěn)定性。國內(nèi)外很多學者對凍干保護劑已有大量的研究，其中甘油和二甲基亞砜的研究揭開了現(xiàn)代凍干保護劑研究的序幕。2010 年Li 等研究發(fā)現(xiàn)保護劑中蔗糖以8%添加后對經(jīng)冷凍干燥的干酪乳桿菌Zhang 具有一定保護作用，凍干后細胞活菌數(shù)為3.20 LogCFU/mL。

Giulio 等研究發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌DSM20081 冷凍干燥前保護劑有海藻糖的添加其保護效果更好，通過冷凍干燥前后活菌計數(shù)結果比較可知凍干存活率顯著增加。添加適宜的保護劑可以大大提高乳酸菌的抗冷凍性，因此研究不同種類的保護劑對乳酸菌保護的作用機理，并對添加的保護劑種類和含量進行優(yōu)化具有重要意義。

2.2、菌體細胞凍干前的預冷處理對其抗冷凍性的影響

細胞經(jīng)預冷處理后其細胞膜脂肪酸的組成和含量發(fā)生變化，且誘導了一些冷激蛋白的合成，用以調(diào)節(jié)自身對外界的冷刺激。因此，細胞在較低的溫度下進行預冷處理可以提高其對于冷凍和低溫保藏的耐受能力。

乳酸菌經(jīng)過預冷處理，在較低的溫度下發(fā)生冷激反應，可以產(chǎn)生冷激蛋白(CSPs)，飽和脂肪酸轉化成不飽和脂肪酸，這些變化對乳酸菌后期的冷凍干燥有極其重要的保護作用。Capozzi等研究了一個熱應激基因失活對植物乳桿菌WCFS1 細胞形態(tài)和細胞膜流動性的影響，通過掃描電鏡觀察基因hsp18.55 缺失的突變體發(fā)現(xiàn)其細胞成簇且表面粗糙。因此，熱應激基因對于乳酸菌細胞膜流動性有著重要的影響。植物乳桿菌NC8、唾液乳桿菌CFR-2158 和嗜熱鏈球菌SFi39及棒狀乳桿菌Si3 分別在8 °C、20 °C、26 °C 預冷處理4 h 后較50 °C 處理30 min 后細胞抗冷凍性高，預冷處理后冷激蛋白CspP 明顯增加，乳桿菌、短乳桿菌和酒酒球菌H-2 經(jīng)?65 °C 冷刺激5 h 后，凍干后的存活率為83%。低溫條件下CspB 和CspE 的增加可以提高乳酸乳球菌的存活率，而CspP 的增多可以提高植物乳桿菌存活的能力。因此，經(jīng)過預冷處理的乳酸菌，細胞膜中脂肪酸的比例影響其抗冷凍能力。

2.3、預冷凍速率對其抗冷凍性的影響

細胞在凍結過程中影響菌體存活率的主要因素是冷凍速率，其中緩慢冷凍過程可以增加細胞的抗冷凍性及保護其生理學特性。Baati 等[30]研究表明，緩慢冷凍可提高細胞的抗冷凍性，嗜酸乳桿菌ATCC4356 在?80 °C 下凍結24 h 活性大大降低，存活率為42.6%，而當其分間斷梯度

(37 °C，20 °C，-4 °C，-20 °C，-80 °C)冷凍時其存活率高達74%。乳酸菌在-20 °C 下每20 min 下降1 °C 要比-40 °C 下每分鐘下降1 °C 可獲得較高的存活率。相關研究表明液氮預凍比在普通緩慢預冷凍條件下保加利亞乳桿菌的存活率高。另外，也有研究報道，冷凍速率在5-180 °C/min 之間時，冷凍過程中胞內(nèi)水分會完全滲出細胞，胞內(nèi)不會出現(xiàn)結晶，細胞存活率較高。但Dumont 等真核生物菌種適宜慢速凍結，而原核微生物菌種經(jīng)慢速凍結和快速凍結后，細胞存活率差異并不顯著。

2.4、冷凍干燥過程對乳酸菌存活率的影響

冷凍干燥結束后，在干燥物質(zhì)的毛細管和極性集團上還吸附著一部分水分，這些是未被凍結的，當它們達到一定含量就為微生物的生長繁殖提供條件。但是，水分含量過高，殘留的自由水與蛋白質(zhì)相互作用，造成蛋白質(zhì)特定構象的改變，同時冰晶體也會形成，這些都會影響其凍干存活率，降低儲存過程中的穩(wěn)定性。同時降低樣品厚度，增大干燥表面積可改善干燥效果，此外采用適度真空度和較高擱板溫度(不能使樣品熔化)時冰晶升華速度快，能減輕樣品過干程度。細胞在凍干的過程中由于真空干燥脅迫細胞失去“結合水”，由代謝過程向休眠狀態(tài)轉化造成部分菌體死亡。研究表明，嗜熱鏈球菌ND03 在升華干燥的過程中，其水分含量由88.3%變?yōu)?%，同時活菌數(shù)降低了20%，當水分含量由89.1%降至3%時，活菌數(shù)僅降低了10%。凍干發(fā)酵劑在25 °C 時Aw 值為0.050?0.200 或水分含量為1.5%-3.0%時，發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性較高，當水分含量大于3.0%或小于0.5%，發(fā)酵劑的凍干死亡率提高，貯藏穩(wěn)定性降低，因此水分含量是產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標之一。因此在冷凍干燥的過程中必須選擇適當?shù)母稍餃囟群蜁r間，確定一個合理的凍干工藝使得凍干后的含水量在一個比較合適的范圍，可以提高凍干存活率，同時可以提高發(fā)酵劑貯藏過程中的穩(wěn)定性。

近幾年國內(nèi)外很多研究表明在制備乳酸菌發(fā)酵劑的過程中，高密度發(fā)酵和真空冷凍干燥工藝對乳酸菌發(fā)酵劑的存活率及后期的低溫貯藏穩(wěn)定性有重要影響，因此在研究乳酸菌發(fā)酵劑的抗冷凍性時不僅要進行保護劑的篩選，更重要的是把握制備發(fā)酵劑高密度發(fā)酵和真空冷凍干燥過程中各項工藝條件對乳酸菌抗冷凍性的重要影響，全面有效地提高乳酸菌發(fā)酵劑和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量，進而提高生產(chǎn)效益。